استخراج DNA با استفاده از DNeasy PowerSoil Pro Kit (LOT: 166013851) همانطور که قبلاً توضیح داده شد (Wagner et al., 2020) انجام شد. نمونه از هر نوع به طور همزمان استخراج شد.
برای تهیه شیلنگ 2 اینچ کشاورزی می توانید به لینک موجود در این سایت مراجعه کنید و هر چیزی که در مورد آن نمی دانستید را بدانید!
یک کنترل منفی (آب تیمار شده با DEPC) برای هر دور استخراج گنجانده شد، گلوله بیوفیلم با استفاده از PBS برای حذف رزین تبادل کاتیونی شسته شد (همانطور که توسط واگنر و همکاران، 2020 توضیح داده شد).
کاغذهای فیلتر (از نمونه های آب منبع) مستقیماً در لوله PowerBead Pro قرار داده شدند. برای تعیین غلظت DNA از اسپکتروفتومتر/فلورومتر DS-11 FX+ (DeNovic) استفاده شد.
حضور اجزای EPS (کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و eDNA) نمونه‌های بیوفیلم شیلنگ آب تعیین شد، اخیراً شرح مفصلی در مورد این روش ها منتشر شده است (واگنر و همکاران، 2020).
به طور خلاصه، مقدار کمی از 1 میلی لیتر برای تعیین کربوهیدرات با استفاده از روش صفحه فنل-سولفوریک اسید استفاده شد. حد کمیت 79 میکروگرم / 10 میلی لیتر معادل گلوکز بود.
مقدار کمی از 1 میلی لیتر برای رسوب پروتئین یک شبه با استفاده از TCA / استون استفاده شد.
نمونه‌های رسوب‌شده در یک SDS-PAGE (15%) بارگذاری شدند و متعاقباً با استفاده از رنگ‌آمیزی نقره رنگ‌آمیزی شدند.
مقدار کمی از 500 میکرولیتر با استفاده از استات سدیم و اتانول رسوب داده شد و با استفاده از اسپکتروفتومتر/فلورومتر DS-11 FX+ (DeNovix) تعیین شد.
برای هر رسوب و کنترل های سنجش (به عنوان مثال، گلوکز برای کربوهیدرات، BSA برای پروتئین، و DNA اسپرم ماهی قزل آلا برای eDNA) گنجانده شد.
مقادیر میانگین و انحراف معیار در R محاسبه و با استفاده از ggplot2 در R مشاهده شد.
بار کل باکتری، بیان شده به عنوان معادل سلول های باکتریایی (BCE)، همانطور که قبلا توضیح داده شد تعیین شد (Dixon et al., 2019).
یک PCR زمان واقعی کمی (qPCR) با استفاده از پرایمرهای 357-F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′) و 518-R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′) برای هدف قرار دادن ژن 16S rRNA (Muyzer et al., 1993) استفاده شد (منحنی استاندارد 1.77 تا 6.77 log BCE، بازده پرایمر 102.8-107.08٪).
مخلوط واکنش شامل 1 x Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qPCR Master Mix با Low ROX (Agilent)، 250 نانومولار پرایمر رو به جلو و معکوس، و 5 میکرولیتر نمونه در یک واکنش 25 میکرولیتری بود.
